X
تبلیغات
میکروبیولوژی - محیط های کشت

محیط های کشت

کشت وتکثیر باکتریها در محیط های مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شناسی است . برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی- حرارت-رطوبت کافی- نمک- PH مناسب- حضور یاعدم حضوراکسیژن می باشد. محيط های كشت را متناسب با نوع آزمايش مي‏توان به دو صورت مايع و جامد تهيه كرد.                  

۱- محيط كشت مايع :

 محيط های مايع به علت نداشتن آگار در تركيب خود به صورت جامد در نيامده و متناسب با نوع ميكروارگانيسم و آزمايشهاي مورد نظر مي‏توان آنها را در لوله‏هاي آزمايش ـ ارلن ماير و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد.

 ۲.محیط كشت جامد :                

 محيط های جامد  به علت دارا بودن آگاردر تركيب خود به صورت جامد بوده و متناسب با ميكروارگانيسم ها و آزمايش هاي مورد نظر مي‏توان آنها را در لوله - ظروف پتري(پلیت)و يا ظروف ديگر مورد استفاده قرار داد . البته محیط های نیمه جامد نیز وجود دارد.که میزان آگار آن نسبت به محیط های جامد کمتر است.مثل SIM

 كشت هاي جامد در لوله را مي‏توان به صورتهاي زير تهيه كرد :

۱. کشت هاي عمقي Stab Cultures :

حدود 5 الي 10 ميلي ليتر از محيط كشت را در لوله آزمايش ريخته و به طور عمودي مي‏گذارند تا محيط بسته شود. سپس ميكروارگانيسمها را توسط سوزن كشت(آنس) به طور عمقي در مركزاين محيط كشت مي‏دهند . 

۲.كشت در داخل محيط جامد Shake Cultures:

به لوله‏هاي آزمايش محتوي محيط كشت جامد پس از ذوب شدن كه تا 45 درجه سلسيوس سرد شده است. باكتري مورد نظر را افزوده و لوله را بين دستها تكان مي‏دهندتا باكتريها كاملا با محيط كشت مخلوط شوند , سپس لوله آزمايش را به طور عمودي قرار مي‏دهند تا محيط بسته شود . 

۳.  كشت شيب دار Slant  Cultures:

حدود 5 ميلي ليتر از محيط كشت جامد (ذوب شده) در لوله آزمايش و يا لوله‏هاي كوچك ديگر ريخته مي‏شود و پس از سترون كردن آنها را به صورت كج به گونه‏اي مي‏خوابانند كه سطح محيط كشت شيب دار باشد . 

 ميكروارگانيسمها را با سوزن كشت(آنس) در عمق و سطح و يا به وسيله فیلدوپلاتین نوك  حلقه‏اي ( لوپ ) در سطح شيب دار كشت مي‏دهند.

كشت جامد در پلیت به سه صورت انجام مي‏گيرد :

۱.كشت خطي در سطح محيط هاي جامد در ظرف پتري:

با اين روش مي‏توان ميكروارگانيسم را بطور خطي توسط فیلدوپلاتین نوك حلقه‏اي (لوپ) در سطح محيط جامد كشت داد.

۲.  كشت در سطح محيط :

 در اين روش توسط پي پت مقداری از رقت معيني از ميكروارگانيسم را در سطح محيط جامد ريخته و با ميله پخش كننده , كاملا در سطح محيط مي‏گسترانند . 

۳.  كشت هاي دو لايه :

در اين روش كشت مايع باكتري (سوسپانسيون باكتري) به محيط كشت ذوب شده (حرارت 45 درجه سلسيوس ) افزوده مي‏شود. در صورت لزوم باكتري را با لايه نازكي از همان محيط كشت مي‏پوشانند و پس از بسته شدن محيط ظرفهاي پتري را به طور واژگون در گرمخانه قرار مي‏دهند تا از ريختن قطرات آب درسطح محيط جلوگيري گردد . 

انواع محيط هاي كشت:

محيط هاي كشت را از نظر تركيب شيميايي و دارا بودن مواد غذائي يا مواد باز دارنده مي‏توان به چند دسته تقسيم كرد . 

 ۱. محيط كشت انتخابي (Selective) :

 اين محيط ها براي جدا كردن يك يا دسته‏اي از ميكروارگانيسم‏ها بكار مي‏روند و به علت دارا بودن مواد بازدارنده، از رشد ميكروارگانيسم‏هاي ناخواسته جلوگيري مي‏كنند مانند محيط  برد باركر جهت جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس و يا محيط S.S براي سالمونلا و شيگلا و يا محيط داراي نمک هاي صفراوي براي جدا كردن كلي فرمها .

2.محيط هاي كشت غني كننده (Enrichment) :

 اين محيط ها معمولا در مواردي به كار مي‏روند كه تعداد ميكروارگانيسم مورد جستجو   درنمونه غذائي كم بوده و يا به علت وجود زياد ميكروارگانيسم‏هاي ديگر جدا كردن آن با اشكال مواجه باشد.اين محيط ها با تركيب خاص خود از نظر pH و مواد غذائي امكان رشد براي ميكروارگانيسم مورد نظر را فراهم مي‏كند،مانند محيط گوشت پخته براي جدا كردن استافيلوكوكوس اورئوس . 

۳.محيط هاي كشت افتراقي (Differential) :

 محيط هايي هستند كه ميكروارگانيسم‏هاي مختلف در آن ويژگيهاي خاص خود را نشان مي‏دهند , مانند محيط هاي خون دار كه در آن نمونه‏هاي هموليتيك و غير هموليتيك از هم جدا مي‏شوند .و محيط مك كانكي آگار كه در آن كلي فرمهاي تخمير كننده لاكتوز پرگنه‏هاي قرمز مي‏دهند . در حالي كه باكتريهاي روده‏اي كه قادر به تخمير لاكتوز نيستند مانند سالمونلا پرگنه‏هاي بي رنگ به وجود مي‏آورند . 

 

          معرفی برخی از محیط های کشت مورد استفاده:

1. Blood agar

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیط های کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتری ها راتامین می کند وهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید.در این محیط برخی دارای همولیز آلفا(ناقص)و برخی بتا(کامل) و برخی گاما(فاقد همولیز)میباشند .نوع همولیز استاف اورئوس بتا میباشد یعنی همولیز کامل.این محیط محیط مناسبی برای هموفیلوس ها نیز می باشد.

      

                                  

همولیز نوع بتا

2. E.M.B

ائوزين متيلن بلو آگار نوعي محيط کشتی است كه براي تشخيص و جداسازي باكتري هاي ميله اي روده اي گرم منفي استفاده مي شود. همچنين ائوزين متيلن بلو آگار مانع از رشد باكتري هاي گرم مثبت مي شود.ولی برخی گرم مثبت ها مانند استافیلوکوک های گواگولاز مثبت و برخی مخمر ها (کاندیدا آلبیکنس) می توانند در این محیط رشد کنند. مبناي افتراق در اين محيط بكارگيري دو رنگ شاخص يعني ائوزين و متيلن بلواست كه متمايزكننده تخميركننده هاي لاكتوز ازارگانيسمهاي فاقد توانايي تخمير لاكتوز مي باشد. در اين محيط باكتري هاي تخمير كننده لاكتوز داراي كلني هايي قرمز پر رنگ و ارغوانی تا بنفش خواهند بود در حاليكه ارگانيسم هايي كه نمي توانند لاكتوز را تخميركنند كلني هاي كاملا بي رنگ یا هم رنگ محیط  خواهند داشت.E.coliدر این محیط جلای سبز فلزی خواهد داشت.

                     

                         

3.Hekton  Enteric agar

هكتون انتريك آگار محيطي انتخابي براي جداسازي و ترميم نمونه هاي مدفوعي متعلق به باكتري هاي روده اي به ويژه سالمونلا و شيگلا است. اين محيط  باكتري هاي تخميركننده لاكتوز را از آنهايي كه نمي توانند از تخمير لاكتوز ، اسيد توليد كنند با ايجاد رنگ زرد - نارنجي روي محيط مناسب در حضور شاخص pH متمايز مي كند . باكتري هايي كه لاكتوز راتخمير نمي كنند، روي محيط تغيير رنگ ایجاد نمي دهند. هكتون انتريك آگارمي تواند توليد گاز هيدروژن سولفيد را با تيره نمودن بخش هايي از محيط  نشان دهد.

                                 

4. Mackonkey agar

مك كانكي آگار محیطی جامد براي متمايز كردن جمعيت زيادي ازميكروبها است.اين محيط اهميت كاربردي زيادي در شناسايي تخميركننده هاي لاكتوز، پاتوژن هاي روده اي گرم منفي دارد.این محیط شامل پپتون, بافر,لاکتوز,کریستال ویوله,املاح صفرابی و معرف نوترال رد است که مانع رشد باكتريهاي گرم مثبت می شود. كلني باكتري هاي تخميركننده لاكتوز،محيط را به رنگ قرمز درمي آورند.رنگ قرمز درنتيجه ايجاد محيط اسيدي بوسيله تخمير كننده هاي لاكتوز شكل مي گيرد.ارگانيسم هايي كه نمي توانند لاكتوز را تخمير كنند، سبب تغيير رنگ نمي شوند.در واقع همرنگ با محیط می شوند.

                                                  

    

5.Mannitol salt agar

يك  محيط انتخابی براي تمايز استافيلوكوكهاي پاتوژن مانيتول سالت آگار است. غلظت بالاي نمك(7.5%) در اين محيط مانع از رشد بيشتر ميكروارگانيسمها مي شود.نه تنهااستافيلوكوك هاي پاتوژن مي توانند در اين محيط رشد كنند بلكه آنها در اين محيط اسيد هم توليد مي كنند.اين اسيد توليد شده به عنوان شاخصpH موجب تغيير رنگ محيط از قرمز به زرد مي شود. استافيلوكوك هاي غير باتوژن نيز قادر به رشد در اين محيط هستند ولي نمي توانند اسيد توليد كرده رنگ آن را تغيير دهند.

                                               

 

6. Mueller Hinton agar  

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطر و اتوکلاو نمودن , محیط را در پلیت های استریل تقسیم نمایید.

                

7.S I M Medium  

 محیطی نیمه جامد که از این محیط برای بررسی حرکت باکتری, توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 ,تست اندول استفاده می شود.

                                 

                                 

8.Salmonella shigelle agar ….SS agar

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت و بسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کند و به عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلا و شیگلا بخصوص از نمونه مدفوع بسیار مناسب است.این محیط حاوی عصاره گوشت ,لاکتوز ,پپتون ,املاح صفراوی ,برلیانت گرین ,سیترات ,آگار ,تلوریت سدیم یا پتاسیم, و معرف نوترال رد است.

                   

9. TSI.......Triple sugar iron agar

این محیط حاوی سه قند گلوگز و لاکتوز و سوکروز است با این تفاوت که میزان گلوگز آن 1%میزان دو قند دیگر است.علاوه بر این قند ها این محیط حاوی پپتون ,تیو سولفات,آهن,آگار,بافر و معرف فنل رد است.روش کشت در این محیط به صورت عمقی و خطی است. و از این محیط برای نشان دادن تخمیر قند ها و تولید CO2,H2S استفاده می شودو نتایج در دو بخش سطح و عمق لوله مورد بررسی قرار می گیرد.و به صورت اسیدی و قلیایی گزارش می شود.باکتری از قند استفاده کرده باشد تمام لوله اسیدی و به رنگ زرد دیده می شود و درغیر این صورت تمام لوله قلیا یی و قرمز خواهد بود.اسیدی شدن را با حرف A و قلیایی شدن را با Alk نشان می دهیم.

A/A:تمام لوله زرد است و باکتری تمام قند را مصرف کرده و سبب اسیدی شدن محیط شده است.

Alk/A:این حالت در طی 72 ساعت نشان دهنده مصرف تنها گلوگز است و بقیه قند ها مصرف نشده اند.

Alk/Alk :هیچ قندی مصرف نشده و محیط تغییر رنگ نمی دهد و شرایط قلیایی است.

اگر باکتری در این محیط قادر به استفاده از تیو سولفات سدیم باشد H2S  تولید می کندکه با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ خواهد داد. همچنین اگر تخمیر قندبا تولید CO2 همراه باشد,حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط را خواهیم داشت.

10.Lysine iron agar  

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دآمیناسیون لیزین استفاده می شود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود.

           

11. Kligleriron agar 

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود .

                    

12. Dnase test agar

در این محیط  فعالیت آنزیم  دزوکسی ریبو نوکلئاز بررسی می شود.این آنزیم به پیوند های DNA حمله می کند این آنزیم یک آنزیم خارج سلولی است که مقاوم به حرارت بوده و برای شناسایی برخی باکتری ها مثل استاف اوروئوس می توان از این محیط استفاده کرد.

                     

13. Endo agar

محیط جامدی است برای جدا سازی کلی فرم ها و سایر باسیل های روده از آب و غذا و سایر نمونه های کلینیکی.

             

14.  Bile Esculine agar

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرا برای شناسایی انتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرا به برخی از استرپتوکوکها ازجمله انتروکوک اجازه رشد می دهد وباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شود و در صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکز و اسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجاد کمپلکس سیاه رنگ می شود.

                          

 

15.MR VP

محیط مایع و حاوی گلوگز است .حال اگر باکتری قادر باشد گلوگز را از راه Mixed acid تجزیه کند اسید حاصله با PH:4-4.5 با معرف متیل رد به رنگ قرمز در می آید.ولی اگر باکتری گلوگز را از راه بوتان دیول تجزیه کند و محصول آن تر کیب حد واسطی مانند استوئین باشد که PH:6-6.5 دارد به معرف متیل رد جواب نمی دهد ولی با محلول پتاس 40% و آلفا نفتول کمپلکس قرمز رنگی ایجاد می کند.

                             

محیط های کشت تنوع بسیار زیادی دارند که تنها به چند مورد از آنها در این بخش اشاره شد.

 

 

 

              

 

+ نوشته شده توسط Reza Kazemi Darsanaki در چهارشنبه هفتم بهمن 1388 و ساعت 8:36 |


Powered By
BLOGFA.COM